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如何找到满意的pcr引物?

2019/12/25

说到PCR引物设计方法,其实掌握一种省时省力又靠谱的方法就够了,今天就和大家聊一聊如何快速找到满意的引物。


1.第一步,先打开pubmed,,选择 gene, 输入基因名,这里以 ATG7为例,点 search。



2.选择正确的基因名和物种,记住基因名下面的那串数字,也就是 gene ID,也可以直接 copy 这串数字。



3.打开 primer bank。网址是:https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/
在 search by 的地方选择 NCBIGene ID,Species 那里选择相应的物种,将上一步 copy 的数字放在 For text 里面,然后点 Submit。


4. 出来了,在 Gene Description 那里再对一下基因信息,确定是自己想找的基因后,在几对引物中选择自己看着顺眼的那对拿去合成就好了。
开玩笑啦,还是有选择标准的:首先看看 Amplicon Size,也就是扩增长度,建议在 100~300bp 间比较好扩增;引物长度在 20~25bp 较好,而且上下游引物间不要相差超过 5bp;再就是看看 Tm 值,60℃左右,相差不要超过 1℃。
综上,将选择好的引物(这里我选择 Primer Pair 3),进一步验证,这里很友好,支持复制粘贴。


5.还是回到 Pubmed,打开里面的 primerblast。网址是:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome) 。
将选中的引物直接 copy 到相应的位置。

在 Database 里选 Refseq mRNA,在 Get Primer 后的第一个小方框上也打个勾,再点 Get Primer,这样结果就会显示在新的标签页。
接着再在 Database 里选 Genomes for selected organisms(primary referenceassembly only),点击 Get Primer。

得到结果:在 Refseq mRNA 的数据库里面我们得到的就是这对引物能扩增出什么产物来,一看结果都是 ATG7,只是有不同的转录本,扩增产物长度也一样,没关系,反正扩出来都是 ATG7。

在 Genomes for selected organisms(primary referenceassembly only)里查找的目的是看看是否用该对引物会扩增出非特异性的产物,没有是最好的,说明引物很特异;如果有,也不要着急,看看到底扩增出来什么?
诶,好像不是我想要的基因,是不是不好啊?不要着急,看看 Product length:1657bp,放心吧,这么长的产物,qPCR 是扩增不出来的(一般 500bp 就比较难扩增出来了)。
所以结合以上判定方法,你选的引物基本上就能跑出漂亮的溶解曲线了,为什么不说百分之一百,因为这还取决于你提取的 RNA 合格不!