Real Time PCR引物设计原则

2019/5/15

荧光定量PCR(Real Time PCR)引物设计目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和引物二聚体要求严格。

Real Time PCR引物设计原则：

★扩增片段大小

80-150 bp(尽量限制在300 bp以内)

★Primer长度

17-25 base

★GC含量

40-60%(最好45-55%)

★★★Tm值

两条引物的Tm值尽量接近，应用专用软件计算Tm值

★序列

整体上碱基不能过偏

个别部分避免GC rich或AT rich(特别是3’ 端)

避免T/C连续，A/G连续

★3’末端序列

3’末端避免GC rich或AT rich

3’末端碱基最好为G或C

3’末端碱基尽量避免为T

★★★互补性

引物内部或两条引物之间避免3 base以上的互补序列

引物3’末端避免2 base以上的互补序列

★★★特异性

使用BLAST检索，确认引物特异性

★★★RT-PCR用引物

尽量在Exon junction上设计引物，限制基因组DNA扩增

注：★表示重要程度，★越多表示越重要，设计时要优先考虑；此外，知恩生物还可以为您提供专业的荧光定量PCR(Real Time PCR)技术服务。